铁死亡与神经退行性疾病、肿瘤、动脉硬化、糖尿病、急性肾损伤等多种疾病相关，致病机理复杂。通过适当的手段，激活或抑制铁死亡，可干预疾病的发展。因此铁死亡成为近年来的研究热点。本期内容将围绕这一热点，以文献为例展开讲述，分享一套关于铁死亡常用的研究思路和方法，并总结了关于铁死亡分子机制的几个关键途径。

一、研究思路和方法

1. 研究思路

目前铁死亡的研究方法基本遵循：

表型→蛋白表达→分子表达→基因敲除/过表达逆转表型

2. 研究方法

1.  形态特征检测

2.  基因表达检测

3.  蛋白水平检测

4.  生化特征指标检测

图1.铁死亡研究方法总结

3. 分子机制

1.  GPX4与脂质过氧化

2.  胱氨酸/谷氨酸转运蛋白(System xc-)

3.  铁代谢作用

4.  p53调控作用

5.  VDACs调控作用

6.  其他调节通路

二、铁死亡分子机制的关键途径

1. GPX4与脂质过氧化

GPX4是细胞内重要的抗氧化酶，能够降解脂质过氧化物，保护细胞免受氧化损伤。当GPX4活性被抑制时，脂质过氧化物大量累积，诱导铁死亡。

2. 胱氨酸/谷氨酸转运蛋白(System xc-)

System xc-是细胞内一个重要的抗氧化系统它通过转运胱氨酸和谷氨酸来维持 GSH的合成当Svstem xc-功能受损时，胱氨酸摄取减少GSH合成受阻，GPX4活性下降，进而促进铁死亡。

3. 铁代谢作用

铁离子的积累是铁死亡发生的关键因素之一。铁离子通过催化脂质过氧化反应，增加ROS的生成，从而加速细胞死亡。细胞内铁的来源包括血红素加氧酶1(HO-1)和转铁蛋白等，它们通过调控铁代谢参与铁死亡的调节。

4. p53调控作用

p53作为一种抑癌基因，通过下调System xc-组分SLC7A11的表达，抑制细胞对胱氨酸的摄取，进而降低GSH和GPX4的水平，增强细胞对铁死亡的敏感性。

5. VDACs调控作用

VDACs是转运离子和代谢产物的跨膜通道。Erastin（铁死亡诱导剂）的铁死亡诱导机制与ROS和铁依赖性信号传导有关，Erastin 能够抑制VDAC2和VDAC3，加速氧化，导致内源活性氧积累。Erastin还破坏线粒体通透性过渡孔 (mPTP)，引起线粒体功能紊乱，氧化性物质释放，最终引起细胞氧化性死亡。

6. 其他调节通路

在氧化应激状态下，甲硫氨酸可通过硫转移途径转化为胱氨酸，合成谷胱甘肽，协助谷胱甘肽过氧化物酶抑制脂质活性氧生成，避免氧化性细胞损伤．因此硫转移途径可抑制铁死亡的发生；血红素加氧酶是细胞内铁的重要来源之一，已被证实可以诱导脂质过氧化反应从而导致铁死亡的发生；转铁蛋白也是细胞内铁的来源之一，它亦参与了铁死亡的调节过程。

三、什么是铁死亡？

1.铁死亡机制

铁死亡（Ferroptosis）是一种独特的程序性细胞死亡方式，在细胞形态，代谢和分子生物学方面，均有别于其他已知的细胞死亡方式。

图2. 铁死亡发生机制

其发生机制如图2：其上游通路是通过直接或间接影响谷胱甘肽过氧化物酶（GPXs）的活性，降低细胞抗氧化能力，致使脂质过氧化反应增加，脂质活性氧增多，引起铁死亡的发生。此外，在Fe2+或酯氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，从而诱导细胞死亡。铁死亡的本质是谷胱甘肽的耗竭，谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）活性下降，脂质氧化物不能通过GPX4催化的谷胱甘肽还原酶反应代谢，之后Fe2+氧化脂质产生活性氧，从而促使铁死亡的发生。

2.主要特征

（1）细胞形态：铁死亡会导致细胞线粒体萎缩变小，嵴减少甚至消失，膜密度增高，细胞膜断裂和出泡，细胞核形态变化不明显。

（2）细胞成分：铁死亡表现为脂质过氧化增高，活性氧(ROS)升高，铁离子聚集，也有一些特征基因发生变化。

四、文献案例

铁死亡研究如此热门，在课题设计过程中，会涉及哪些方向的实验呢？我们以2021年刊登在Clinical and translational medicine杂志题为“Deubiquitinase USP35 modulates ferroptosis in lung cancer via targeting ferroportin”论文为例。

题目四要素：疾病（lung cancer）、表型(ferroptosis)、主变量分子(USP35)、机制(ferroportin)四部分内容。

研究思路及方法如下：

（1）现象

USP35基因的敲低可抑制肺癌细胞的生长、集落的形成和肿瘤的进展。

实验：CCK8检测，细胞克隆形成，肿瘤变化检测，WB检测，qPCR检测。

（2）本质

当干扰USP35的基因表达后，细胞活力下降，通过各种细胞死亡抑制剂处理后，发现细胞坏死，凋亡以及自噬抑制剂对细胞活力下降没有影响，但是铁死亡抑制剂能够缓解细胞死亡现象，初步考虑USP35影响细胞的铁死亡现象，然后通过铁死亡相关指标检测发现USP35敲低后，细胞铁死亡指标发生明显变化。

实验：CCK8检测，细胞克隆形成，脂质活性氧检测，HETEs检测，GSH以及GPX4检测，LIP检测。

Nec-1：细胞坏死抑制剂

Z-VAD：细胞凋亡抑制剂

CQ：自噬抑制剂

Fer-1：铁死亡抑制剂

Lip-1：铁死亡抑制剂DFO和CPX是铁螯合剂

DFO和CPX是铁螯合剂

（3）验证

验证一：过表达USP35对癌细胞以及体内肿瘤没有明显作用；当处理铁死亡诱导剂的同时过表达USP35能发现不论是细胞还是在体肿瘤都进一步发展。USP35过表达阻断了erastin/rsl3介导的肿瘤抑制作用。

实验：CCK8检测，qPCR检测，细胞克隆形成，体内肿瘤实验

Erastin和RSL3铁死亡诱导剂

验证二：USP35的过表达能缓解Erastin和RSL3引起的铁死亡；能够降低Erastin和RSL3引起的铁蓄积，但对GSH和GPX4没有明显影响。

实验：脂质活性氧检测，HETEs检测，GSH以及GPX4检测，LIP检测，Fe2+检测。

验证三：在H1650细胞中干扰USP35能够引起细胞活性减低和肿瘤生长抑制，并通过铁死亡指标发现是铁死亡现象；用Erastin和RSL3处理引起癌细胞铁死亡的同时过表达USP35能够促进细胞增殖和肿瘤发展，改善铁死亡现象。

实验：qPCR检测，CCK8检测，在体肿瘤检测，脂质活性氧检测，GSH以及GPX4检测，LIP检测，Fe2+检测。

（4）机制

机制一：USP35不影响GSH代谢相关蛋白也不影响cystine摄取，但是影响铁转运蛋白FPN（ferroportin）；过表达USP35降低了肺癌细胞内的LIP和Fe2+，而在FPN缺陷的细胞中却没有降低。此外，在敲除内源性FPN后，过表达USP35所降低的脂质ROS和MDA的生成也被影响。

实验：WB检测，LIP检测，Fe2+检测。

机制二：干扰FPN后，能够增加LIP和Fe2+的水平，增加ROS和MDA含量；通过CCK8，细胞克隆形成实验以及在体肿瘤检测，发现干扰FPN表达能够促进细胞铁死亡，抑制肿瘤进展；同时在肺腺癌以及肺鳞癌组织中FPN是高表达的。FPN是USP35调节铁死亡和肿瘤进展的潜在靶点。

实验：WB检测，CCK8检测，细胞克隆形成检测，在体肿瘤检测，LIP检测，Fe2+检测，脂质ROS检测，MDA检测。

机制三：USP35敲低会增加，而过表达USP35降低了泛素化的FPN水平；IP实验证明FPN与内源性USP35能够结合，且通过MG132蛋白酶抑制剂证明了USP35可以直接与FPN相互作用，并作为一种去泛素酶来维持其蛋白的稳定性。

实验：WB检测，IP检测。

综上，到目前为止，仍然没有判定铁死亡的“金指标”，即决定性的代谢指标来判定一个细胞死亡模型是否为铁死亡，首先需要检测相关的指标（如亚铁、MDA、GSH/GSSG、GPX4、SLC7A11蛋白、PCG2等）是否出现变化，再使用铁死亡的抑制剂实验，观察是否能逆转细胞死亡和相关指标的变化。

图3. 铁死亡研究思路借鉴

参考文献1：DOI:10.1016/j.cell.2022.06.003

参考文献2：DOI:10.1002/ctm2.390

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